[대학교 생화학실험] Part2. 이론적 배경 편 – 친화 크로마토그래피(Affinity Chromatography)/브래드포드 분석법(Bradford Assay)

by. 엽토친화 크로마토그래피 설명 Part2를 준비해 왔습니다.이번 포스팅에서는 MBP-tag 친화 크로마토그래피에 대한 이론적 배경을 알아봅니다!

이 실험의 프로토콜(protocol)에 대해 알고 싶다면, 이 포스트로 가보세요!

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세포를 쪼개는 방법은 여러 가지가 있지만 우리는 그 중 초음파 분해(sonication)를 사용했습니다.말 그대로 초음파를 세포에 집중시켜 세포벽이나 세포막을 찢는 방법입니다!​

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크로마토그래피란 혼합물을 분리하기 위해 사용되는 방법이에요.그 중에서도 친화 크로마토그래피는 특정 시기를 인식하는 단백질을 분리할 수 있습니다.우리가 분리하는 단백질이 인식하는 특정의 그릇을 “X”로 봅니다.

친화 크로마토그래피는 크게 4단계로 구성되어 있습니다.첫 번째 스텝은 charging step! X(=혹은 X의 유도체)가 칼럼에 공유 결합하도록 합니다(=covalently attaching X(orderivative of X) to acolumn), 다음 단계는 loading step입니다.칼럼에 단백질 혼합물을 넣는 단계입니다.세 번째는 washing step! 결합하지 않은 단백질을 씻어내기 위해 버퍼로 washing해 주십시오.그러면 X와 결합된 단백질, 즉 목표 단백질만 칼럼 안에 남아 있겠죠?X가 칼럼에 붙어있으니까요!마지막 네 번째는 elution step입니다.목표 단백질이 분리되어 나오도록 용해되는(soluble) 타입의 X를 고농도로 첨가하거나 환경에 변화를 주어 결합의 친화성(binding affinity)을 감소시킵니다.X로 무엇을 사용하느냐에 따라 친화 크로마토그래피의 종류가 나뉘는데 그 중에서도 MBP-tag친화 크로마토그래피를 했습니다.MBP란, Maltose binding protein의 약어입니다.MBP를 tagging protein이라 쓸 경우, 친화 크로마토그래피의 칼럼에는 아밀로스(amylose)를, elution buffer에는 사탕당(maltose)을 사용합니다.

등전점(pI)은 단백질 입자의 전하가 0이 되는 pH라고 배웠죠? 잘 기억이 나지 않으면 아래의 포스팅을 복습합니다! https://blog.naver.com/hafs_snu/220956555873

단백질 버퍼의 용액은 pH가 pI와 일치하는 상황에서 단백질이 불용성이 된다고 합니다.(아마 우리가 사용하는 용매는 극성이기 때문에 pH가 pI의 경우 단백질에 입자의 전하가 없고 무극성에 가깝기 때문에 녹기 어렵다고 보면 될 것 같습니다) 이번 실험에서 사용하는 버퍼는 크게 두 가지인데, Worman 버퍼와 elution 버퍼입니다.Work man 버퍼의 조성을 보면, HEPES-KOHP H7.5, NaCl, 글리세롤, Tween-20, PMSF가 되고 있습니다.Tween-20은 약한 계면활성제(detergent)입니다.PMSF(phenylmethanesulfonylfluoride)는 셀린단백질가수분해효소억제제입니다.PMSF의 경우 Worman buffer가 제대로 작동하기 위해서는 꼭 필요하나 첫 번째 실험실에 있는 Worman buffer의 경우 PMSF가 포함되어 있지 않습니다.따라서 PMSF는 Worman 버퍼 사용 직전에 별도로 추가해 주십시오.Maltoseelution buffer(사탕용리액)는, Tris-HCLpH7.5, NaCl, EDTA, 사탕당으로 구성되어 있습니다.​

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Tag 혹은 tagging protein은 우리의 목표 단백질(target protein)에 추가로 붙인 단백질입니다.저희같은경우에는친화크로마토그래피로목표단백질을분리하기위해서taggingprotein을붙였습니다.예를 들어, 친화 크로마토그래피에 사용할 수 있는 단백질 Y가 있고 Y를 목표로 단백질에 tagging해 주었다고 하겠습니다.그러면 Y에 대한 친화 크로마토그래피를 실시하면 자연스럽게 목표 단백질을 분리할 수 있겠죠?목표 단백질은 Y라는 tagging protein과 공유 결합으로 연결되어 있기 때문입니다! (물론 이 사이에 아미노산이 몇 개 들어 있기도 합니다.)

그 중에서도 우리가 실험에 사용한 MBP-tag에 대해 더 자세히 알아보겠습니다.MBP-tag는 대장균에서 유래한 것으로, 크기는 42.5kDa입니다.MBP-tag를 붙인 단백질은 MBP fusion protein이라고 합니다.MBP-tag의 장점을 크게 세 가지로 꼽아요!1. 높은 습득률: N-말단에 MBP domain을 붙여 리보솜 결합 자리 옆에 위치하도록 하면 번역 시작이 효율적으로 이루어져 높은 습득률을 얻을 수 있습니다.용해도 향상: 목표 단백질이 불용성 상태로 축적될 수 있습니다.이때 목표 단백질에 MBP를 붙이면 용해될 수 있습니다.3. 높은 친화성: 아밀로스 레진에 대한 친화성이 높고 아밀로스 레진에 대한 선택성(selectivity)을 갖는 것도 큰 장점입니다.​

이전에 질적 분석법인 SDS-PAGE에 대해서 배웠죠?이번에 다룰 브래드포드 분석법은 양적 분석법의 하나로 색상을 사용해 단백질의 양을 판단하는 분석법(colorimetric prote indetermination method)입니다.Coomassie Brilliant BlueG-250(=CoomassieG-250, Coomassie Blue)이라는 염료를 사용합니다.쿠마시 블루는 산성의 조건하에서 대부분이 양성자를 2개 가지는 양이온형으로 붉은 기를 띠고 있습니다.중성 조건에서는 양성자를 1개 가지고 초록색을 합니다.염기성 조건에서는 양성자가 없는 음이온형으로 푸른색을 띠고 있습니다.

브래드퍼드 용액(Bradfordreagent)은 산성크마시 블루 용액입니다.그래서 대부분의 양성자를 두 개씩 가지고 있는데 빨간색을 나타냅니다.브래드포드 분석법에서 Coomassie Blue가 단백질과 안정적으로 결합하기 위해서는 양성자를 2개를 갖는 형태가 되어야 합니다.곰시블루가 단백질과 만나면 최초의 전자를 단백질의 전하를 띠는 기들(charged groups)에게 줍니다.그러면 단백질 구조가 바뀌면서 소수성 포켓(hydrophobic pocket)이 노출됩니다.그래서 쿠마시 블루가 이 소수성 주머니에 결합하고, 술이나 휴대전화-산(sulfonic acid)기는 양전하를 띤 아민에 결합합니다.반데르발스력에 의한 인력도 작용합니다.따라서 곰시블루가 단백질에 안정적으로 결합하면 양성자가 없는 푸른색을 띠게 됩니다. (만약 Coomassie Blue가 전자를 제공했는데 단백질에 결합하지 않으면 중성이라 녹색을 띠게 됩니다.) 따라서 브래드포드 용액을 넣었을 때 단백질 양이 많을수록 진한 파란색이 됩니다!곰시 블루가 단백질과 결합한 정도를 분광 분석법으로 측정할 수도 있거든요.단백질이 없으면 염료는 붉은색을 띠며, 이 경우 브래드퍼드 용액의 최대 흡수 파장은 470nm예요(실제로 실제 갈색에 더 가깝습니다), 단백질이 있으면 염료는 파란색을 띠며, 브래드퍼드 용액의 최대 흡수 파장은 595nm가 됩니다.시료에 있는 단백질의 양은 파란색을 띠고 있는 곰 씨 블루의 비율과 비례합니다.(단백질이 많을수록 더 많은 곰시블루가 단백질과 결합하여 푸른색을 띨 것입니다) 그러므로 595nm에서의 흡광도를 측정하면 단백질의 양을 정량적으로 분석할 수 있습니다!

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우선 background를 제거하고 단백질의 양을 측정하는데 표준 용액을 사용하겠습니다.표준 용액을 위한 단백질로는 BSA(bovine serumal bumin)가 주로 사용됩니다.기존에 알려진 BSA용액을 사용하여 표준 그래프를 그립니다.그렇게 하면 OD 값과 BSA 농도 사이의 관계식(1차 방정식)을 얻을 수 있습니다!그리고 우리 시료의 OD값을 측정하고 위식에 대입해 보면 시료의 단백질 농도를 계산할 수 있습니다. (이 때, 희석 얼마나 했는지 등도 유의해서 생각해야 합니다!계산을 제대로 해놓고 5배 희석된 시료를 사용한 것을 잊고, ×5하지 않고 답을 제출하면…고대에는 틀렸습니다) 저희는 시간 관계상 정량적 분석은 하지 않고 시료가 파랗게 변하는 정도만 육안으로 확인했습니다.

[자료출처] KAIST 2018 가을학기 생화학실험 Biochemistry Experiement (BS200) Lecture Note/Protocol/Homeworkhtps://www.genscript.com/bacterial-soluble-protein-expression-MBP-tag.html

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